新型冠狀病毒N-蛋白檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫法）說明書
【產(chǎn)品名稱】
通用名稱：新型冠狀病毒N-蛋白檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫法）
【包裝規(guī)格】
96人份／盒
【預期用途】
本品定性檢測血清或血漿樣品中新型冠狀病毒核衣殼（N）抗原。
傳染性非典型肺炎，又稱嚴重急性呼吸道綜合癥（Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS），是一種新出現(xiàn)的傳染病[1]。SARS的致病原已于2003年4月16日由世界衛(wèi)生組織確定為一種新的冠狀病毒，命名為SARS冠狀病毒（SARS－CoV）[2]。SARS自2002年11月首先在我國廣東地區(qū)發(fā)生后，已在30多個國家和地區(qū)傳播流行，造成了8422人感染，其中死亡人數(shù)為916（2003年8月7日前統(tǒng)計）[3]，根據(jù)現(xiàn)有資料[4-6]，該病主要通過呼吸道飛沫、體液及污物等方式近距離轉播，有家庭聚集性和醫(yī)院聚集性的特點。其主要的臨床特征為起病急，發(fā)燒、咳嗽、肺部陰影、外周血白細胞不升高或者降低。盡管對病原體的研究取得了很大進展，但在病原生物學特性，發(fā)病機制，早期有效的診斷試劑、特異性治療等方面的研究尚未獲得突破性的進展，尚有一系列的問題需要解決。尤其是SARS早期診斷是困擾臨床醫(yī)生對該病及早發(fā)現(xiàn)、隔離及治療等的一大難題，因為同一種病毒感染不同個體可表現(xiàn)出不同的臨床特征，而不同的病毒感染又會出現(xiàn)相同的臨床特征，所以，僅靠臨床癥狀和流行病學資料很難確定病毒感染真正的病原，最終的確診往往需要實驗室的診斷，目前尚未有成熟的客觀實驗室診斷標準。由于大多數(shù)病毒性疾病尚沒有特效治療藥物，實驗室診斷已成為控制病毒性疾病流行和蔓延的重要手段。當務之急是盡快研究有效的診斷試劑，早診斷、早隔離、切斷傳播途徑，控制疫情蔓延。
對于SARS冠狀病毒感染的實驗室診斷，目前主要包括以下幾種方法：以PCR和基因芯片技術為基礎的分子診斷；以抗體監(jiān)測為基礎的血清學診斷；以體外病毒培養(yǎng)為基礎的病原生物學診斷。
目前，對SARS冠狀病毒感染的實驗室早期診斷主要是以PCR為基礎的病毒核酸測定?，F(xiàn)有的實驗數(shù)據(jù)顯示在發(fā)病14天左右病毒核酸的敏感性大約為70％[7，8]，由于病毒RNA容易降解，檢測結果易受樣品收集和處理的影響，而且樣品污染可以造成假陽性，因此，需要嚴格的質量控制和經(jīng)培訓的技術人員熟練操作。另外需要專門的檢測儀器并且價格昂貴，鑒于以上這些因素，有很多醫(yī)院尚不能開展。
以特異性抗體監(jiān)測為基礎的血清學診斷，目前所采用的方法有兩種：酶聯(lián)免疫吸附法和免疫熒光法。血清抗體由陰性轉為陽性以及從急性期到恢復期抗體滴度增加4倍以上表示感染是在近期發(fā)生的。由于特異性抗體在發(fā)病7～10開始出現(xiàn)，因此，抗體血清學檢測不能用于SARS的早期診斷。
以體外病毒培養(yǎng)為基礎的病原生物學診斷,從患者標本中分離到SARS-CoV是實驗室診斷的“金標準”，但由于試驗條件等的限制，一般不作為常規(guī)的方法。而且技術難度高，操作復雜，所需時間長，對設備要求高，不適于臨床醫(yī)院使用。
以特異性抗體為基礎的病原學診斷，是對SARS實驗室早期診斷的方法，是用已知的特異性抗體檢測樣品中病毒抗原。用特異性抗體建立病毒抗原診斷試劑盒的技術難度是需要特異性很高的單克隆抗體或多克隆抗體。成熟雜交瘤技術在多種疾病的免疫學診斷中已起到了巨大的作用，由于單克隆抗體具有高度特異的免疫學性質，可以構建高敏感特異的抗原檢測試劑，這已被以往多種病毒抗原檢測試劑所證實[9-11]。
由于已經(jīng)證明SARS-CoV是一種正義單鏈RNA病毒?；蚪M結構分析表明，SARS-CoV基因編碼結構蛋白由釘子糖蛋白（spike glycoprotein，S）、包膜小蛋白（small envelope，E）、膜蛋白（membrane，M）和核衣殼蛋白（nucleocapsid protein，N）等組成。盡管對這些結構蛋白的功能目前尚不清楚，但從冠狀病毒生物學特性研究發(fā)現(xiàn)，病毒包膜上的蛋白很容易發(fā)生變異，而核衣殼蛋白卻相對穩(wěn)定，其抗原性比其他結構蛋白強，而且是病毒主要的抗原部分。因此，在獲得高純度、高特異性的病毒N抗原的基礎上，免疫動物，從而得到高親和力、高特異性的單克隆抗體和高效價多克隆血清，建立了測定SARS-CoV冠狀病毒抗原的試劑盒。
【檢驗原理】
本品系用純化的抗新型冠狀病毒抗體（3株抗重組N蛋白的單克隆抗體）包被的微孔板和兔抗N蛋白抗原多抗、辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔IgG、陰性對照、陽性對照和顯色液及其他必要輔助試劑制成，采用雙夾心法ELISA原理：待測抗原與固相載體表面的抗體形成抗原抗體復合物，加入兔抗N蛋白抗體形成雙抗體夾心免疫復合物，然后加入羊抗兔酶標記抗體，形成（抗體－N抗原－二抗－抗二抗酶標記物）免疫復合物，加入底物后在酶作用下產(chǎn)生顏色反應，通過儀器測定酶促反應的強弱即可定性檢測待測樣品中的N蛋白。
【主要組成成分】
1. 本試劑盒包含的組分：
序號 組分名稱 主要成分 裝量
1 預包被新型冠狀病毒N蛋白單抗的微孔板 微孔板中預包被3株抗重組N蛋白的單克隆抗體。 96孔
2 兔抗SARS-COV N蛋白抗體 兔抗新型冠狀病毒N蛋白免疫血清，Tris-NaCl緩沖液，含0.1% Proclin-300、0.001%苯酚紅、蛋白穩(wěn)定劑。 7.0mL×2支
3 HRP標記的羊抗兔IgG  辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔IgG抗體，硼酸鹽緩沖液，含0.1% Proclin-300、0.001%苯酚紅、蛋白穩(wěn)定劑。 7.0mL×2瓶
4 陽性對照 新型冠狀病毒重組N蛋白，硼酸鹽緩沖液，含0.02%硫柳汞、蛋白穩(wěn)定劑。 1.0mL×1支
5 陰性對照 正常人血清或血漿，硼酸鹽緩沖液，含0.02%硫柳汞、蛋白穩(wěn)定劑。 1.8mL×1支
6 顯色液A 檸檬酸、過氧化氫。 6.5mL×1瓶
7 顯色液B 檸檬酸、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）。 6.5mL×1瓶
8 濃縮洗滌液（10倍） 磷酸鹽緩沖液，含Tween-20，10倍濃縮。 50mL×2瓶
9 終止液 0.5 mol/L H2SO4溶液。 6.5mL×1瓶
10 密封袋  1個
11 封板膜  4片
12 記錄紙  1份
注：兔抗SARS-COV N蛋白抗體、酶標記物、陽性對照、陰性對照，必須使用試劑盒配備的，不同批次不可混用。顯色液A、顯色液B、終止液、濃縮洗滌液為通用試劑，不同批次可以混用。
2. 需要但未提供的材料：
蒸餾水或去離子水
微孔板清洗器
5μL～40μL、40μL～200μL 、200μL～1mL移液器與一次性吸嘴
37℃恒溫設備
微孔振蕩器
酶標儀
60分鐘或更長時程的計時器
【儲存條件及有效期】
于2℃～8℃避光保存，有效期為6個月。
拆封后未用完的微孔板應放入密封袋內2℃～8℃保存。各組分拆封后應在一個月內用完。
生產(chǎn)日期、失效日期：詳見標簽。
【適用儀器】
具有450nm波長的酶標儀
【樣本要求】
采樣注意事項：因SARS冠狀病毒有較強的傳染性，能通過近距離密切接觸傳播，采集樣本時必須做好充分的安全防護。采樣容器用專用管架盛載。采完樣后立即密封送檢。此類標本應由專人專柜隔離保存。須標記清晰，切勿與其它病原體標本混放。采樣過程應嚴格按《傳染性非典型肺炎病例實驗室檢測標本采集技術指南》操作執(zhí)行。
靜脈采血后，室溫放置1～2小時，離心分離出血清；如取血漿，采血后可直接離心分離血漿。如在24小時之內使用可于2℃～8℃中保存，長期存放應保存在－20℃以下，并避免反復凍融。高濃度的脂類、膽紅素及溶血樣本或微生物污染對測定結果的影響尚未確定。
血清樣本或血漿樣本于56℃滅活30分鐘，對測定結果沒有影響，其他滅活條件對測定結果的影響尚未確定。
【檢驗方法】
1.  試驗過程注意事項
1.1  試劑盒各組分從冷藏環(huán)境中取出時，應在室溫平衡至無潮氣方可使用。不同批試劑組分不得混用。拆封后未用完的包被板應放入密封袋內保存。
1.2  試劑盒不要長時間放置于室溫下，應于2℃～8℃保存，避免冰凍，并在有效期內使用。在儲存及孵育過程中，應避免強光直接照射。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染。
1.3  為避免試劑或樣品的微生物污染及交叉污染，應使用一次性吸嘴，不要重復使用。
1.4  在取用對照品、兔抗SARS-COV N蛋白抗體和酶標記物之前應輕輕搖動使其充分混勻，加樣前，使用微孔振蕩器充分混勻樣品。
1.5  嚴格遵守規(guī)定的孵育時間和溫度。如果第一孔與最后一孔加樣時間間隔太長，將會導致不同的“預孵育”時間，從而影響測量值的準確性及重復性。
1.6  洗滌結束時，應將微孔板倒扣于紙巾上并輕輕敲打，確保所有孔內均無殘留洗滌液，避免產(chǎn)生泡沫。如果使用自動洗板機，應注意正確操作。
1.7  每次試驗必須設陰性及陽性對照。
1.8  試驗操作應嚴格遵守《傳染性非典型肺炎實驗室生物安全操作指南》。
2.  試驗準備
2.1  試劑盒反應試劑準備
2.1.1  微孔條
將檢測所需數(shù)量的微孔條固定于板架上，剩余的微孔條放入密封袋中保存。
2.1.2  洗滌液
在干凈的量筒內稀釋濃縮洗滌液。50mL濃縮洗滌液加入蒸餾水或去離子水至500mL，混勻。
2.1.3  其它液體組分
直接使用，使用前應輕輕搖動使其充分混勻。
2.2  樣品準備
待檢樣品不用稀釋，充分混勻后使用。測定臨床樣本時必須嚴格按照衛(wèi)生部、科技部、國家食品藥品監(jiān)督管理局頒布的《傳染性非典型肺炎病毒研究實驗室暫行管理辦法》。
3.  檢測過程
3.1  每次實驗每板須設空白孔1孔、陽性對照2孔、陰性對照3孔。空白孔不加樣品、兔抗N蛋白抗體和酶標記物，只加洗液、顯色液A、B和終止液；陽性對照、陰性對照直接使用，100L/孔。其余每孔加入樣品100L。
3.2  加封板膜置37℃溫育60分鐘。
3.3  吸凈孔中液體，洗板5次，每次停留30秒后甩凈拍干。
3.4  除空白對照外每孔加兔抗N蛋白抗體100L，加封板膜置37℃溫育60分鐘。
3.5  吸凈孔中液體，洗板5次，每次停留30秒后甩凈拍干。
3.6  除空白對照外每孔加酶標記羊抗兔IgG抗體100L，加封板膜置37℃溫育60分鐘。
3.7  吸凈孔中液體，洗板5次，每次停留30秒后甩凈拍干。
3.8  拍干后各孔滴加顯色液A、B各50L，置37℃避光10分鐘，每孔立即加入終止液50L，輕微震蕩微孔板以混合均勻。
3.9  以空白孔調零，用酶標儀讀取450nm處的A值。
4.  質量控制
陽性對照A值平均值≥0.50，陰性對照A值平均值≤0.20，證明實驗成立。
【陽性判斷值】
臨界值（CUT OFF）＝0.09＋陰性對照平均A值（當陰性對照平均A值小于0.10時，按0.10計算；當陰性對照平均A值大于或等于0.10時按實際值計算），結果判斷如下：
樣品A值＜臨界值×0.8                   陰性
臨界值×0.8≤樣品A值＜臨界值            可疑
樣品A值≥臨界值                        陽性
【檢驗結果的解釋】
1. 本試劑盒臨界值是依據(jù)檢測1297例健康人血樣及臨床考核的檢測結果而確定。
2. 本試劑盒的檢測結果不是臨床適應癥的唯一確認指標，測定結果要密切結合臨床指征及其他測定結果進行綜合分析。
3. 可疑及陽性樣品應進行第二次實驗來復核，并進行雙孔測定。
4. 對于檢測結果陽性的報告，只表明該樣品中有新型冠狀病毒的蛋白存在，并不表明有活病毒存在，或病毒量足以感染其他人。
5. 臨床考核結果表明，本品的測定結果會因采樣時間的不同而異，因此檢測為陰性的樣品不能排除新型冠狀病毒的感染。
6. 可疑樣品除重復檢測外，還應當對該病例進行高密度連續(xù)采樣（如每天一次）并及時檢測抗原，以期盡早地確定其是否感染；有條件時也應當追蹤其更早期的血清標本并檢測抗原，以排除已經(jīng)錯過其抗原峰值期的可能性；對于發(fā)病10天后的病例，應當同時進行抗體檢測。
【檢測方法的局限性】
1. 本品所用抗體系針對新型冠狀病毒核衣殼蛋白，其靈敏度和特異性雖已進行了相關的實驗室和臨床研究確證，但鑒于目前對于SARS各發(fā)病階段，病毒在人體各組織部位的分布及持續(xù)時間等方面的基礎研究工作還有待深入，因此，其靈敏度和特異性還需進一步的研究與確證。
2. 試驗結果雖然表明本檢測系統(tǒng)與特異性項目中所列病毒的培養(yǎng)液無交叉反應性，但未進行這些病毒感染樣本的臨床考核。與其他（特異性項目中所列病毒以外）病原體的交叉反應尚沒有實驗數(shù)據(jù)。
3. 本試劑使用鼠單克隆抗體及兔多克隆抗體，因此陽性結果也可能是某些患者體內具有高滴度人抗鼠或人抗兔抗體所引起的，如診斷或治療中接受過鼠單克隆抗體制劑的患者等。
4. 本品對臨床確診SARS患者連續(xù)監(jiān)測的結果表明，只有在病程的早期（1～10天），本品才有相對較高的陽性檢出率，而在發(fā)病晚期，本品檢測結果多數(shù)為陰性。
5. 對于檢測陰性的樣本，不能完全排除樣本中新型冠狀病毒的存在。以下原因均可導致陰性結果：
5.1 患者并未感染新型冠狀病毒，而是由其他并未測定過的病原體（如病毒、細菌、真菌等）引起發(fā)病。
5.2 由于檢測靈敏度限制，造成假陰性結果。
5.3 樣本中的病毒或病毒蛋白可能只在一定的時期內存在，樣本并未在病毒或病毒蛋白存在時被采集。
6. 目前對血清高滴度抗體是否影響抗原檢測結果還有待進一步研究。
【產(chǎn)品性能指標】
1. 外觀
包裝盒應整潔，產(chǎn)品批號和有效期正確清楚。液體組分應清亮，無沉淀物或絮狀物。
2. 陰性參考品符合率
16份陰性參考品檢測結果不得出現(xiàn)假陽性（16/16）。
3. 陽性參考品符合率
16份陽性參考品檢測結果不得出現(xiàn)假陰性（16/16）。
4. 最低檢出量
共7份，要求至少檢測出4份為陽性樣品，而且基質血清必須陰性，即4/7。
5. 精密性
用精密性參考品進行檢測，CV（%）應不高于15％（n＝10）。
6. 穩(wěn)定性試驗
出廠前37℃放置3天后進行檢測，其陽性參考品符合率、陰性參考品符合率、最低檢出量和精密性均應符合要求。
7. 生物安全性
試劑盒中對照品要求HBsAg、HIV-Ab、HCV-Ab及梅毒螺旋體抗體檢測為陰性。
【注意事項】
1．本品所有試劑均不具有傳染性，但仍需按傳染性物質對待。
2．任何臨床樣本都應作為具有傳染性樣品對待。各項試驗要參照執(zhí)行由科技部、衛(wèi)生部、國家食品藥品監(jiān)督管理局、國家環(huán)境保護總局聯(lián)合下發(fā)的《傳染性非典型肺炎病毒研究實驗室暫行管理辦法》和《傳染性非典型肺炎病毒的毒種保存、使用和感染動物模型的暫行管理辦法》的有關規(guī)定。
3．樣本的采集方法對采樣人員有一定的危險性，采樣人員應高度重視安全防護。
4．實驗室中所有各種廢棄物都應按傳染物處理。實驗中用過的吸頭應直接打入盛有1%次氯酸鈉的廢物缸內，并與其它廢棄物一同在指定的地點以指定的方式進行焚燒或毀棄。
5．試驗結束后應立即清潔工作臺。工作臺及各種試驗用品應定期用1%次氯酸鈉、75%酒精或紫外燈進行消毒。
6．注意避免皮膚或黏膜直接接觸試劑或樣品。顯色液中含TMB，終止液含硫酸。含TMB的試劑在試驗中會誘發(fā)其它反應；含硫酸的試劑有腐蝕性。一旦接觸到這些液體，應立即用水徹底清洗。
【標識的解釋】
包裝標簽
的標識    
標識的含義 溫度限制 體外診斷醫(yī)療器械 參考使用說明 不得二次使用
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【基本信息】
注冊人/生產(chǎn)企業(yè)名稱：珠海經(jīng)濟特區(qū)海泰生物制藥有限公司
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生產(chǎn)許可證編號：粵食藥監(jiān)械生產(chǎn)許20040941號
【醫(yī)療器械注冊證書編號/產(chǎn)品技術要求編號】國械注準20173401143
【說明書核準及修改日期】2017年6月28日