麻疹病毒和風疹病毒核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）說明書
【產(chǎn)品名稱】
通用名稱：麻疹病毒和風疹病毒核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）
【包裝規(guī)格】10人份/盒，20人份/盒，50人份/盒。
【預期用途】
本品用于定性檢測咽拭子樣本中麻疹病毒(MV)和風疹病毒(RV)核酸。
麻疹病毒是單股負鏈RNA病毒，屬于副粘病毒科麻疹病毒屬。麻疹是一種由麻疹病毒引起的一種急性呼吸道傳染病，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、出疹、咳嗽。
風疹病毒是披膜病毒科風疹病毒屬的唯一成員，為單股正鏈RNA病毒，風疹是一種由風疹病毒引起的急性發(fā)熱出疹傳染病，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱和出疹，包括先天性感染和后天獲得性感染。臨床上以前驅期短、低熱、皮疹和耳后、枕部淋巴結腫大為特征。
麻疹和風疹均是通過呼吸道傳染，以急性發(fā)熱出疹為特征的傳染病，常出現(xiàn)流行或爆發(fā)，嚴重危害兒童和青少年的健康。從臨床表現(xiàn)上風疹、麻疹與其它發(fā)熱出疹性疾病難以鑒別。實驗室檢測方法目前主要有病毒分離、血清學檢測、核酸檢測等。
【檢驗原理】
本品采用實時熒光PCR技術，以麻疹病毒和風疹病毒基因組保守區(qū)作為擴增靶區(qū)域，設計特異性引物和探針進行PCR擴增，在一個反應體系中定性檢測樣品是否含有麻疹病毒或者風疹病毒核酸。本品含有內標檢測系統(tǒng)可監(jiān)控核酸提取、反轉錄及PCR擴增過程，避免出現(xiàn)假陰性檢測結果。
【主要組成成分】
組份名稱 主要成分 規(guī)格及數(shù)量（單位：支）
  10人份/盒 20人份/盒 50人份/盒
反應液A 引物、探針、dNTP、Mg2+、K+。 180μl×1 360μl×1 900μl×1
反應液B 反轉錄酶、DNA聚合酶、RNA酶抑制劑、甘油。 35μl×1 65μl×1 160μl×1
陽性對照 含麻疹病毒和風疹病毒特異性片段的質粒。 20μl×1 50μl×1 100μl×1
陰性對照 經(jīng)焦碳酸二乙酯處理的純化水。 500μl×1 500μl×1 500μl×1
【儲存條件及有效期】
避光-20±5℃儲存，有效期12個月。
反復凍融次數(shù)不宜超過10次，開封后-20℃下三個月內用完。生產(chǎn)日期及失效日期見標簽。
【適用儀器】
ABI7500、Stratagene Mx3000P、Bio-Rad CFX96熒光PCR儀。
【樣本要求】
適用標本類型為咽拭子。
樣本采集：將無菌棉拭子稍蘸生理鹽水，反復涂抹患者咽部數(shù)次，然后將棉拭子浸于1 mL～2 mL標本維持液（含500～1 000單位（Unit，U）/mL青霉素、500 μg/mL～1 000 μg/mL鏈霉素和2％牛血清DMEM液）或者VTM中，并反復擠壓后，棄棉拭子。
樣本采集后應及時檢測，-20±5℃保存期6個月，-70℃可以長期保存。樣本避免反復凍融，如不可避免，反復凍融次數(shù)不宜超過5次，采用低溫運輸。
【檢驗方法】
1. 樣本處理（樣本制備區(qū)）
用QIAGEN公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit（貨號：52904）或者本公司的核酸提取試劑盒（貨號：HT5025，備案號：粵珠械20140038號）提取RNA，按說明書操作。
2. PCR試劑準備（試劑準備區(qū)）
從試劑盒中取出反應液A、反應液B，室溫融化后振蕩混勻，瞬時離心數(shù)秒后使用。
取N個（N=待測樣本數(shù)+陰性對照+陽性對照）PCR反應管，每管反應液配制如下表：
反應液組份 加量（μl）/人份
反應液A 17
反應液B 3
總體積 20
將各組份充分混合后，瞬時離心數(shù)秒。
3. 加樣（樣本制備區(qū)）
向上述對應的反應管中分別加入提取的待測樣本RNA、陰性對照和陽性對照各5μl，蓋緊管蓋，瞬時離心后轉移至擴增檢測區(qū)。
4. PCR擴增檢測（擴增檢測區(qū)）
4.1  將反應管放入熒光PCR儀進行擴增檢測。
4.2  循環(huán)參數(shù)設定（請參照各類儀器的操作說明進行設置）
步驟 溫度 時間 循環(huán)數(shù)（次）
1 逆轉錄反應 47℃ 30min 1
2 預變性 95℃ 10min 1
3 變性 95℃ 10s 45
4 退火、延伸及收集熒光 56℃ 45s 
步驟4中56℃時熒光檢測，檢測通道：ROX / Texas Red通道為內標，F(xiàn)AM通道為麻疹病毒， HEX/ VIC通道為風疹病毒。
在ABI7500熒光PCR儀中不選ROX校正，淬滅基團選None。
4.3  結果分析
反應結束后需要通過調節(jié)Baseline的Start值、End值以及Threshold值，點擊Analysis自動獲得分析結果。
【陽性判斷值或者參考區(qū)間】
采用受試者工作曲線（ROC）確定本試劑盒的麻疹病毒的陽性判斷值為Ct＜38；風疹病毒的陽性判斷值為Ct＜38。
【檢驗結果的解釋】
質量控制
1. 陰性對照：無典型S型擴增曲線顯示；
2. 陽性對照：FAM和HEX檢測通道均呈典型S型曲線且Ct值≤30，同時ROX檢測通道有
或無擴增曲線；
3. 以上要求需要在同一個實驗中同時滿足，否則本次實驗無效，需重新進行。
結果判讀
1. 陰性結果的判讀：
如果FAM、HEX檢測通道無擴增曲線或Ct≥40，ROX檢測通道有擴增曲線，可判樣品為麻疹病毒、風疹病毒陰性；
2. 陽性結果的判讀：
如果FAM檢測通道有擴增曲線且Ct＜38，ROX檢測通道有或無擴增曲線，可判樣品為麻疹病毒陽性；
如果HEX檢測通道有擴增曲線且Ct＜38，ROX檢測通道有或無擴增曲線，可判樣品為風疹病毒陽性；
3. 可疑結果的判讀：
如果FAM檢測通道有擴增曲線且38≤Ct＜40，ROX檢測通道有或無擴增曲線，則該樣品需要進行復測，如復測結果FAM的Ct值仍然在38~40范圍，有明顯指數(shù)增長期，可判樣品為麻疹病毒，否則樣品為麻疹病毒陰性。
如果HEX檢測通道有擴增曲線且38≤Ct＜40，ROX檢測通道有或無擴增曲線，則該樣品需要進行復測，如復測結果HEX的Ct值仍然在38~40范圍，有明顯指數(shù)增長期，可判樣品為風疹病毒陽性，否則樣品為風疹病毒陰性。
【檢驗方法局限性】
1. 樣本收集、處理、運輸及保存的失誤都可能導致錯誤的結果；
2. 樣本處理時發(fā)生交叉污染，可能會出現(xiàn)假陽性結果；
3. 病毒的基因突變也可能導致假陰性結果；
4. 本方法由于引物探針較多，可能形成引物二聚體導致假陽性結果。
【產(chǎn)品性能指標】
1. 最低檢測限：麻疹病毒/風疹病毒均為5TCID50/ml。 
2. 精密性：批內精密度變異系數(shù)≤5%，批間精密度變異系數(shù)≤5%，。
3. 特異性：本品與登革病毒、乙型腦炎病毒、水痘帶狀皰疹病毒、腮腺炎病毒、流感病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、HIV弓形蟲、巨細胞病毒、I型單純皰疹病毒、II型單純皰疹病毒、呼吸道合胞病毒未見交叉反應，與其他病原體反應尚無實驗數(shù)據(jù)。
4. 亞型檢測能力：可檢出麻疹病毒H1a、A、B3、D8、D9型，風疹病毒2B、1E型，其他型別尚無實驗數(shù)據(jù)。
5. 干擾性試驗：常見干擾物質如青霉素、地塞米松、維生素C、撲熱息痛、血液、膿液、病毒靈在檢驗樣本中的濃度分別為20μg/ml、0.3μg/ml、30μg/ml、20μg/ml、25%、25%、200mg/ml時，不會影響到樣本檢測結果。
6. 本品在臨床試驗中檢測596份咽拭子樣本，與參比方法比較：
對于麻疹檢測，靈敏度為100%、特異度為95.7%、粗一致性為97.5%。
對于風疹檢測，靈敏度為100%，特異度為97.1%，粗一致性為97.6%。
【注意事項】
1. 本品為體外診斷試劑，操作人員應進行專業(yè)培訓并具備一定的相關經(jīng)驗；
2. 為保證實驗結果的準確性和可靠性請使用已校準的移液器，實驗用具（一次性PCR反應管、吸嘴、離心管等）需選用去RNA酶處理過的產(chǎn)品；
3. 實驗需要嚴格分區(qū)進行（試劑準備區(qū)、樣本制備區(qū)、擴增檢測區(qū)），各區(qū)物品、工作服均為專用，不得交叉使用，實驗后要及時進行清潔；
4. 樣品處理必須在生物安全柜中進行，以保護操作人員安全并防止環(huán)境污染；
5. RNA樣本應保存于-70℃冰箱中，加樣前應在室溫充分融化、混勻并瞬時離心后使用；
6. 每次實驗應設置陰性對照和陽性對照。不同批號的試劑切勿混用，在有效期內使用試劑盒；
7. MV/RV PCR反應液A與MV/RV PCR反應液B混合后，應盡快完成實驗，否則隨著時間延長而擴增效果變差；
8. 實驗過程中佩戴一次性口罩和一次性頭套，勤換一次性薄膜手套；
9. 觸摸PCR管時切忌戴乳膠手套，防止汗液或乳膠手套上的粉末等影響熒光值檢測；
10. 反應液加入模板后應顛倒混勻，輕彈管壁去除氣泡，瞬時離心；
11. 使用過的吸嘴應打入盛有10%次氯酸鈉的廢液缸中，實驗結束后與其他廢棄物一同集中處理；
12. 擴增完畢后應小心取出PCR管放入密封袋中，嚴禁在PCR實驗室開蓋，如果開蓋，氣溶膠會對PCR室造成污染，實驗結果會出現(xiàn)假陽性；
13. 實驗結束后應用10%次氯酸鈉或75%酒精處理工作臺和移液器，然后紫外照射30分鐘；
14. 本品涉及的待測樣本應視為具傳染性物質，避免直接接觸身體。樣本操作和處理均需符合衛(wèi)生部《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通用準則》和《醫(yī)療器械管理條例》相關要求；
15. 本品的內標檢測系統(tǒng)僅在風疹病毒、麻疹病毒檢測均為陰性時作為對采樣及提取效果的評價，當出現(xiàn)風疹病毒、麻疹病毒陽性時，內標出現(xiàn)與否不影響結果的判讀。
【標識的解釋】
                                                
  溫度限制      體外診斷醫(yī)療器械       參考使用說明       不得二次使用
【參考文獻】
Mosquera Mdel M，de Ory F，Moreno M，Echevarria JE．Simultaneous detection of measles virus，rubella virus，and parvovirus B19 by using multiplex PCR．J Clin Microbiol，2002，40(1)：111-116．
【基本信息】
注冊人/生產(chǎn)企業(yè)名稱：珠海經(jīng)濟特區(qū)海泰生物制藥有限公司
住所：珠海市唐家灣鎮(zhèn)港灣大道創(chuàng)新四路18號         郵政編碼：519085
聯(lián)系方式：電話號碼：0756-3890858             傳真號碼：0756-3890848
生產(chǎn)地址：珠海市唐家灣鎮(zhèn)港灣大道創(chuàng)新四路18號     郵政編碼：519085
生產(chǎn)許可證編號：粵食藥監(jiān)械生產(chǎn)許20040941號
【醫(yī)療器械注冊證書編號/產(chǎn)品技術要求編號】國械注準20183400480
【說明書核準日期及修改日期】2018.11.07